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外泌體是一種40~160nm的細(xì)胞外囊泡，可由血細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞等在內(nèi)的幾乎所有類型的細(xì)胞分泌，并分布在各種體液中。外泌體是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵介質(zhì)，及各種生理和病理過程中的功能介質(zhì)。

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以穿梭蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA和DNA等生物活性分子，且具有高生物利用度、生物穩(wěn)定性、靶向特異性、低毒性和低免疫原性，使得外泌體在疾病診斷、治療及藥物遞送中極具潛力。

美國ClinicalTrials臨床試驗數(shù)據(jù)庫資料顯示，外泌體可作為肺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌等不同腫瘤的診斷生物標(biāo)志物或治療藥物，還可作為藥物遞送系統(tǒng)、腫瘤疫苗；此外，外泌體還可用于再生醫(yī)學(xué)。然而，至今尚未有任何的外泌體療法批準(zhǔn)上市，外泌體的臨床轉(zhuǎn)化仍面臨著諸多問題及挑戰(zhàn)。

外泌體發(fā)展歷程

外泌體是細(xì)胞外囊泡常見亞群之一。EV是由生物細(xì)胞分泌的納米級具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡，是各種具有膜結(jié)構(gòu)的囊泡的統(tǒng)稱，主要包括外泌體及微囊泡、微粒、外體、遷移體、腫瘤體和凋亡體等。現(xiàn)代研究證明，外泌體可影響腫瘤的各種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成、腫瘤耐藥和免疫反應(yīng)等。

1981年，Trams等人從各種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中培養(yǎng)出具有5′-核苷酸酶活性的脫落囊泡，囊泡的平均直徑為500~1000nm，并且通常含有直徑約40 nm的第二群囊泡，這是關(guān)于外泌體的最初描述。1983年，Harding等人和Pan等人分別在大鼠和綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中，觀察到含有未降解的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體與直徑約50 nm的小囊泡發(fā)生相互作用。隨后在1987年Johnstone將其正式命名為“外泌體”。

2013年，James E. Rot hman、Randy W. Schekman和Thomas C. Südhof三位科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)并闡釋細(xì)胞囊泡運輸系統(tǒng)及調(diào)控機制而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

外泌體的組成及生理功能

外泌體含有DNA、RNA、mRNA、脂質(zhì)、代謝物、細(xì)胞質(zhì)和蛋白質(zhì)等多種生物分子。研究顯示，目前已在外泌體中鑒定出9769種蛋白質(zhì)、2838種miRNA、3408種mRNA和1116種脂質(zhì)。其中，細(xì)胞膜常規(guī)的四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81等）、熱休克蛋白70（Hsc70）、溶酶體蛋白（Lamp2b）、腫瘤敏感基因101（Tsg101）、融合蛋白（CD9、flotillin，annexin）等蛋白在外泌體中的濃度較高，可作為外泌體鑒定的生物標(biāo)志物。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞等在內(nèi)的幾乎所有類型的細(xì)胞都可以產(chǎn)生外泌體，進(jìn)行細(xì)胞間通訊，從而實現(xiàn)細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)、炎癥調(diào)控、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能。

外泌體最初被認(rèn)為是細(xì)胞用來排泄廢物的小泡，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)外泌體可參與到機體免疫應(yīng)答、抗原遞呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等。

不同細(xì)胞來源的外泌體組成不同，其功能也不同。例如，樹突狀細(xì)胞分泌的外泌體具有MHC肽復(fù)合物，能夠激活T細(xì)胞，還可表達(dá)表面配體，如腫瘤壞死因子配體（TNF）、Fas配體（FasL）和TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL），從而和腫瘤細(xì)胞上的TNF受體結(jié)合，觸發(fā)半胱天冬酶活化和腫瘤凋亡。干細(xì)胞來源的外泌體包含與MSCs類似治療性的生長因子及mRNA等生物活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等療效。癌細(xì)胞來源的外泌體能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致免疫抑制或避免免疫反應(yīng)。

外泌體的分離方法

目前，研究人員已根據(jù)外泌體的大小、密度、表面電荷以及其表面相關(guān)的蛋白質(zhì)開發(fā)了多種外泌體分離方法，主要包括超速離心、超濾、體積排阻色譜、免疫親和捕獲、聚合物沉淀法和微流控技術(shù)（各技術(shù)原理及優(yōu)缺點見下表）。

由表1可知，外泌體分離方法已得到大量擴展，常用方法有差速超速離心、密度梯度離心法、沉淀法、過濾法、體積排阻色譜法以及免疫親和捕獲法等，其中差速超速離心仍是長期以來外泌體分離的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，目前分離技術(shù)都存在一定缺陷，如何提高外泌體分離的純度、效率和質(zhì)量仍是攻克外泌體分離技術(shù)難題的主要挑戰(zhàn)。

外泌體臨床應(yīng)用

外泌體幾乎存在于所有的細(xì)胞、組織和體液中，是介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)。研究認(rèn)為，外泌體可通過與細(xì)胞膜直接融合，以及通過內(nèi)吞途徑或配體-受體相互作用在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮作用，從而參與到機體免疫應(yīng)答、抗原遞呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等。

目前，外泌體被廣泛用于生物標(biāo)志物、藥物載體和疾病治療研究中。

藥物遞送系統(tǒng)

外泌體可通過內(nèi)吞作用或經(jīng)過囊泡和細(xì)胞膜的直接融合進(jìn)入受體細(xì)胞，使其內(nèi)容物輸送到細(xì)胞質(zhì)中并引發(fā)功能反應(yīng)。如來自抗原呈遞細(xì)胞（樹突狀細(xì)胞）的外泌體可以通過將負(fù)載肽的MHCⅠ類和Ⅱ類復(fù)合物轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞，來調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞反應(yīng)。

外泌體作為一種潛在的藥物遞送系統(tǒng)，類似于脂質(zhì)體，具有包裹親水核心的獨特雙脂膜，可裝載親水和親脂材料；由于外泌體具有不同脂質(zhì)、表面蛋白、受體等，具有更好的組織和細(xì)胞靶向性；此外，外泌體由細(xì)胞自身產(chǎn)生，具有較好的生物相容性、低免疫原性和低毒性，可避免外源性的蛋白類、核酸類等藥物進(jìn)入體內(nèi)被免疫系統(tǒng)識別而遭到清除。目前，應(yīng)用外泌體載藥的藥物類型主要為小分子化藥、核酸和蛋白質(zhì)。

外泌體載藥方式可以分為外源性裝載（即外泌體分離后）和內(nèi)源性裝載（即外泌體生物發(fā)生期間）兩種。

內(nèi)源性裝載是在外泌體形成的生物過程中，通過直接轉(zhuǎn)染、共孵育等方法將目的藥物導(dǎo)入外泌體來源細(xì)胞，來源細(xì)胞再通過生物發(fā)生機制產(chǎn)生具有目的藥物的外泌體。目前，內(nèi)源性裝載可裝載RNA、蛋白質(zhì)、小核酸和小分子等不同類型藥物。

外源性裝載是通過電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法將目的藥物導(dǎo)入分離后的外泌體中。目前，外源性裝載可裝載小分子化藥、蛋白質(zhì)、多肽、核酸藥物、天然產(chǎn)物等，裝載藥物方式主要包括直接共孵育、電穿孔、超聲處理、轉(zhuǎn)染、擠壓、凍融、表面活性劑透化（詳見下表）。

診斷及預(yù)后標(biāo)志物

外泌體已被證明有望用作許多疾病的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，包括乳腺癌、泌尿道癌、肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等癌癥，以及帕金森病、阿茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并且關(guān)于外泌體作為診斷工具的研究正在迅速擴展到其他疾病。

目前研究結(jié)果顯示，外泌體蛋白、miRNA、circRNA、l ncRNA均具有潛在的診斷和治療價值，如外泌體蛋白CD26、CD81、S1C3A1和CD10可用作為肝損傷潛在的生物標(biāo)志，外泌體miR-21和miR-1246在乳腺癌患者中升高更為顯著，可作為乳腺癌的生物標(biāo)志物。外泌體生物標(biāo)志物與傳統(tǒng)生物標(biāo)志物（血清、尿液等）相比，具有更高的靈敏度和特異性，以及更出色的穩(wěn)定性。

疾病治療

近年來，研究證實外泌體對多種疾病具有治療潛力。例如，研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可以穿過血腦屏障，作為炎癥反應(yīng)和神經(jīng)損傷再生的調(diào)節(jié)劑；從心球源細(xì)胞中分離的外泌體，當(dāng)注射到缺血小鼠模型中時，可以抑制細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)心臟細(xì)胞的生長，等等。外泌體的治療作用基于其細(xì)胞內(nèi)穿梭能力、穿越血腦屏障能力、低免疫原性、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以及增加或抑制炎癥的能力等。

與干細(xì)胞相比，外泌體在臨床治療的潛在優(yōu)勢包括：無任何基于細(xì)胞的療法（包括干細(xì)胞）相關(guān)的固有風(fēng)險；無復(fù)制潛力和惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險；可避免對感染和癌癥的免疫原性反應(yīng)；可直接靶向目標(biāo)組織或細(xì)胞。

外泌體臨床研究進(jìn)展

據(jù)美國ClinicalTrials數(shù)據(jù)庫資料顯示，截至2023年8月21日，ClinicalTrials共登記了182項關(guān)于外泌體的臨床研究，主要涉及外泌體生物標(biāo)志物、外泌體治療、外泌體藥物遞送系統(tǒng)。

182項外泌體領(lǐng)域的臨床研究中，有90項（49.45%）是關(guān)于生物標(biāo)志物的應(yīng)用，59項（32.97%）為外泌體治療藥物研究，8項（4.40%）關(guān)于藥物遞送系統(tǒng)，22項（12.09%）屬于外泌體基礎(chǔ)分析研究；此外，疫苗類臨床研究有3項（1.10%）（詳見圖）。

上述59項外泌體治療藥物的臨床研究中，可明確臨床試驗階段的有46項。其中，Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗最多（16項），其次為Ⅰ期（10項），Ⅲ期臨床試驗最少（2項），Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗有3項。

兩項Ⅲ期臨床試驗涉及兩款外泌體產(chǎn)品，分別為CAP-1002、Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Derived Extracellular Vesicles。

CAP-1002是由Capricor Therapeutics Inc研發(fā)的一種基于外泌體的細(xì)胞療法，擬開發(fā)適應(yīng)證包括X連鎖遺傳病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、肌病、肌肉萎縮性疾病、肌營養(yǎng)不良、神經(jīng)肌肉疾病和遺傳病。

Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Derived Extracellular Vesicles是由Direct Biologics研發(fā)的一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡療法，擬開發(fā)適應(yīng)證包括成人呼吸窘迫綜合征、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等。

外泌體領(lǐng)域代表企業(yè)

外泌體自被發(fā)現(xiàn)以來，已歷經(jīng)40余年發(fā)展，全球布局外泌體領(lǐng)域的企業(yè)數(shù)量及規(guī)模也在不斷增長。據(jù)公開資料統(tǒng)計，近50家外泌體Biotech公司的研發(fā)方向主要聚焦在腫瘤（30%）、腦部疾?。?6%）、肺部疾病（7%）、皮膚病（5%）、疫苗開發(fā)（13%）、醫(yī)美修護（8%）、肝臟疾病（5%）、腎臟疾病（3%）以及基因治療/罕見?。?3%）等領(lǐng)域。

以下是布局外泌體領(lǐng)域的代表性企業(yè)情況。

Aethlon Medical

Aethlon Medical成立于1999年，是一家上市醫(yī)療器械公司，專注于開發(fā)腫瘤、傳染性疾病及其他一些威脅生命疾病領(lǐng)域的創(chuàng)新醫(yī)療設(shè)備。

Aethlon核心產(chǎn)品Hemopurifier是一款血液凈化器，可快速消除促癌外泌體和循環(huán)病毒。美國食品藥品管理局（FDA）已批準(zhǔn)Hemopurifier 為突破性設(shè)備，用于治療對標(biāo)準(zhǔn)治療無反應(yīng)或不耐受的晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥患者，以及外泌體已被證明參與疾病進(jìn)展或嚴(yán)重的癌癥患者，以及尚無獲批治療藥物的危及生命的病毒。

Aethlon控股子公司Exosome Sciences成立于2017年，致力于開發(fā)外泌體生物標(biāo)志物，以診斷、監(jiān)測腫瘤及神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前正在推進(jìn)開發(fā)TauSomeTM生物標(biāo)志物，作為診斷活體個體慢性創(chuàng)傷性腦病候選血液測試的基礎(chǔ)。

Celularity

Celularity成立于2017年，是一家臨床階段生物技術(shù)公司，致力于開發(fā)胎盤來源的同種異體細(xì)胞療法和外泌體。細(xì)胞療法包括未經(jīng)修飾及基因修飾的NK細(xì)胞、工程化T細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）、間充質(zhì)樣貼壁基質(zhì)細(xì)胞。

該公司開發(fā)胎盤外泌體（pEXO）作為潛在的治療方法，可以提供促再生因子，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞、血管和肌肉的發(fā)育。目前，該公司外泌體產(chǎn)品管線有1款處于啟動新藥臨床試驗（IND）階段。

Codiak Biosciences

Codiak Biosciences是一家成立于2015年的生物技術(shù)公司，也是外泌體領(lǐng)域第一家上市公司，專注于開發(fā)基于外泌體的新型藥物療法。

Codiak開發(fā)了其專有的engExTM平臺，以擴展外泌體的固有特性，設(shè)計、工程和制造新的外泌體治療候選藥物。Codiak曾利用engExTM平臺開發(fā)了一系列工程外泌體，旨在治療廣泛領(lǐng)域的疾病，包括腫瘤學(xué)、神經(jīng)腫瘤學(xué)、神經(jīng)病學(xué)、神經(jīng)肌肉疾病和傳染病等。

然而，Codiak于今年3月29日自愿向美國特拉華州破產(chǎn)法院申請破產(chǎn)保護，出售資產(chǎn)。

Evox Therapeutics

Evox Therapeutics成立于2016年，是一家臨床前階段生物技術(shù)公司，致力于開發(fā)基于外泌體的創(chuàng)新療法來治療罕見病和嚴(yán)重疾病。

外泌體藥物可解決基于蛋白質(zhì)、抗體和核酸療法的一些局限性，使其能夠遞送到目前通過常規(guī)手段無法到達(dá)的細(xì)胞和組織。Evox開發(fā)了其專有技術(shù)平臺DeliverEXTM，可利用各種分子工程、藥物裝載和靶向策略來修飾外泌體，以促進(jìn)靶向藥物遞送到感興趣的器官，如大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

目前，Evox正在開發(fā)一系列基于外泌體遞送的候選藥物，包括針對成人及兒童苯丙酮尿癥的外泌體遞送的編碼苯丙氨酸羥化酶（PAH）的AAV（腺相關(guān)病毒），以及針對神經(jīng)退行性疾病的外泌體遞送的siRNA藥物等。

Xsome Biotech

Xsome Biotech成立于2021年，是一家臨床前階段生物技術(shù)公司，致力于開發(fā)用于多種疾病的外泌體療法和新型藥物遞送載體。

Xsome建立了外泌體再生醫(yī)學(xué)及工程化外泌體藥物遞送平臺。外泌體再生醫(yī)學(xué)平臺利用肺球細(xì)胞來源的天然外泌體，開發(fā)治療肺部疾病候選外泌體療法產(chǎn)品；工程化外泌體藥物遞送平臺利用HEK293細(xì)胞外泌體裝載mRNA、重組蛋白、小分子藥物等，以治療腫瘤、特發(fā)性肺纖維化及罕見病等。

目前，Xsome核心候選藥物XO101已獲得美國FDA的IND許可，用于治療COVID19-ARDS患者；肺球細(xì)胞衍生的外泌體候選藥物XSO201，也正在準(zhǔn)備申報IND。

臨床開發(fā)面臨的主要問題

外泌體在疾病診斷、治療以及藥物遞送方面的作用已眾所周知。然而，從實驗室到臨床的轉(zhuǎn)化仍然存在各種挑戰(zhàn)。

缺乏規(guī)模化制備及標(biāo)準(zhǔn)化方法

外泌體廣泛存在于各種體液中，可以從各種類型的細(xì)胞中分離出來，不同來源的外泌體，其組成也可能不同。目前根據(jù)外泌體的尺寸、理化特性已建立了多種外泌體分離方法，但至今最純凈的外泌體是利用蔗糖或碘沙醇通過密度梯度分離方法分離的，然而這種方法耗時長、成本高。其他方法如“金標(biāo)準(zhǔn)”差速超速離心法的設(shè)備昂貴，且離心力可能會破壞外泌體的結(jié)構(gòu)和功能；微流控技術(shù)分離同樣存在設(shè)備昂貴、產(chǎn)量低的問題?？梢?，現(xiàn)有外泌體的分離技術(shù)無法滿足外泌體規(guī)?；苽涞男枨蟆?/p>

此外，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)方案，可能導(dǎo)致每批次間產(chǎn)品的差異，從而影響治療效果。

外泌體藥物相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)不完善

目前，在外泌體的分離與鑒定、質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，已生產(chǎn)或正在生產(chǎn)中的外泌體也無完整的審批標(biāo)準(zhǔn)。

在我國，近兩年相關(guān)研究單位相繼制定了多項關(guān)于人多能干細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡的團體標(biāo)準(zhǔn)，包括《人多能干細(xì)胞來源的小細(xì)胞外囊泡》（T/CRHA 002-2021）、《人間充質(zhì)干細(xì)胞來源的小細(xì)胞外囊泡》（T/CRHA 001-2021）、《人干細(xì)胞來源細(xì)胞外囊泡制備通用要求》（T/CSCB 0007-2022），以進(jìn)一步推動并規(guī)范外泌體行業(yè)的發(fā)展。

然而，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)性仍不足。未來若國內(nèi)企業(yè)申報外泌體產(chǎn)品IND，可能需要與藥監(jiān)部門進(jìn)行大量溝通，IND申報材料和內(nèi)容可能要大量修改。

缺乏權(quán)威第三方檢測專業(yè)機構(gòu)

依據(jù)我國藥品監(jiān)管規(guī)定，新藥在申報IND時，均應(yīng)經(jīng)過專業(yè)第三方檢測機構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)符合性檢驗合格。然而，目前中國食品藥品檢定研究院及其他專業(yè)檢測機構(gòu)尚未對外泌體檢驗檢測建立標(biāo)準(zhǔn)。

監(jiān)管亟待完善

目前，全球范圍內(nèi)已有超過100多家企業(yè)或私人診所直接向消費者銷售基于干細(xì)胞外泌體的新藥物，其中約30%的企業(yè)位于美國。美國FDA曾于2019年12月6日發(fā)布關(guān)于外泌體產(chǎn)品的公共安全通知，以規(guī)范外泌體的上游生產(chǎn)步驟，但仍存在企業(yè)直接向消費者提供未經(jīng)證實的外泌體療法的情況。

盡管面臨諸多挑戰(zhàn)，但外泌體憑借其天然形成機制，以及包含大量多樣活性生物分子的特殊結(jié)構(gòu)，可以承載多元化的臨床價值，在腫瘤治療、細(xì)胞替代治療、再生醫(yī)學(xué)、藥物載體、科研模型等方面顯示了巨大應(yīng)用潛力。相信隨著技術(shù)的突破，外泌體將會迎來跨越式發(fā)展。

 （藥渡咨詢 吳夏?吳莎莎）

(責(zé)任編輯：陸悅)