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帶磁性的核在外加磁場(chǎng)中會(huì)產(chǎn)生能級(jí)裂分，吸收對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的電磁波就會(huì)發(fā)生能級(jí)的躍遷，停止電磁波照射后通過(guò)自旋晶格弛豫回到平衡態(tài)，產(chǎn)生核磁共振效應(yīng)。經(jīng)過(guò)核磁共振科學(xué)家多年不懈的努力后，二維核磁技術(shù)終于在20世紀(jì)70年代開(kāi)始走向成熟，走向應(yīng)用，典型的有同核COSY、DQF-COSY、TOESY、NOESY、ROESY技術(shù)，異核HMQC、HMSC、HSQC技術(shù)，另外還有研究核與核之間相互作用的NOE技術(shù)[1]。新藥發(fā)現(xiàn)的一個(gè)主要途徑是化合物文庫(kù)和天然化合物的的篩選以及為了活性性質(zhì)優(yōu)化的大量結(jié)構(gòu)類似化合物的合成。這些過(guò)程耗費(fèi)大量人力物力，且風(fēng)險(xiǎn)很高，而這些技術(shù)為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用帶來(lái)了極大的便利。從20世紀(jì)末核磁共振技術(shù)首次成功運(yùn)用于先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)過(guò)程開(kāi)始，一場(chǎng)新的藥物發(fā)現(xiàn)技術(shù)革命悄然誕生。

FK506結(jié)合蛋白抑制劑先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)[2]

FK506結(jié)合蛋白和FK506結(jié)合，抑制鈣調(diào)磷酸酶和阻止T細(xì)胞活化，為了尋找FK506和結(jié)合蛋白結(jié)合的抑制劑，F(xiàn)esik等人避開(kāi)了傳統(tǒng)的篩選路徑，開(kāi)發(fā)了一套嶄新的藥物先導(dǎo)化合物篩選發(fā)現(xiàn)途徑，具體總結(jié)過(guò)程如下圖所示：

圖1.基于核磁共振技術(shù)的分子設(shè)計(jì)步驟示意圖

上圖A是靶標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)第一輪小分子化合物配體篩選得到B，小分子與蛋白的結(jié)合作用可以通過(guò)N同位素標(biāo)記的HSQC技術(shù)觀察酰胺質(zhì)子和氮原子的化學(xué)位移來(lái)識(shí)別，由于蛋白是N同位素標(biāo)記，而化合物沒(méi)有進(jìn)行N同位素標(biāo)記所以小分子底物不會(huì)干擾蛋白化學(xué)位移信號(hào)，從而提高了信噪比。第一個(gè)配體得到后經(jīng)過(guò)一系列的藥物化學(xué)修飾得到優(yōu)化后的C，下面的目標(biāo)則是尋找結(jié)合蛋白相鄰位點(diǎn)的配體，確定的依據(jù)仍是核磁譜圖中化學(xué)位移變化的相關(guān)情況，第二個(gè)配體粗選后繼續(xù)經(jīng)過(guò)藥物化學(xué)的修飾得到活性最高的小分子化合物如上圖E。在兩個(gè)先導(dǎo)配體被選定后，通過(guò)核磁共振或者X-射線衍射技術(shù)得到三元復(fù)合物在空間的相對(duì)位置和小分子配體的空間取向，通過(guò)設(shè)計(jì)合適的連接子將兩個(gè)配體片段連接起來(lái)得到最后的先導(dǎo)化合物上圖F。

在FK506結(jié)合蛋白的抑制劑篩選過(guò)程中，第一輪篩選發(fā)現(xiàn)化合物文庫(kù)發(fā)現(xiàn)如下圖化合物1具有最高的活性，化合物1不經(jīng)過(guò)進(jìn)一輪的優(yōu)化作為第一個(gè)配體，可以通過(guò)酰胺化學(xué)位移的變化斷定化合物1的結(jié)合位置和FK506哌啶酸部分的結(jié)合位置一致。在化合物1飽和的條件下，繼續(xù)尋找與相鄰結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的小分子配體，通過(guò)對(duì)化合物庫(kù)的篩選初步得到化合物2具有一定的活性，通過(guò)對(duì)在化合物1飽和的情況下化合物2加入后化學(xué)位移的變化，可以斷定化合物2和化合物1的結(jié)合位點(diǎn)相近。

圖2.化合物1和2的結(jié)構(gòu)圖

化合物2經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)進(jìn)一輪的構(gòu)效關(guān)系研究得到最終高活性的化合物3。

圖3.化合物3的結(jié)構(gòu)圖

通過(guò)基于同位素濾波核磁共振試驗(yàn)建立三元復(fù)合物的空間模型，化合物1的甲酯結(jié)構(gòu)和化合物3的苯環(huán)上的羥基結(jié)構(gòu)在空間位置上比較接近，設(shè)計(jì)連接子跨過(guò)空間連接兩個(gè)小分子配體，要保證設(shè)計(jì)的連接子不影響小分子配體在空間的位置和結(jié)構(gòu)取向，設(shè)計(jì)如下圖的分子結(jié)構(gòu)。

圖4.連接子連接后的化合物結(jié)構(gòu)和生物活性圖

最終結(jié)果顯示化合物10具有最高的活性，化合物14的分子式如下圖，它采用了另一種連接方式，活性也達(dá)到了49nM。

圖5.化合物14結(jié)構(gòu)圖

為了觀察兩個(gè)小分子配體在連接之前和連接之后與結(jié)合蛋白的結(jié)合作用部位的變化，分別進(jìn)行NOE研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1和化合物14的哌啶酸部分和三甲氧基苯基部分結(jié)合部位一樣，與蛋白形成疏水相互作用，另外化合物3與化合物14的結(jié)合位置相似，化合物3的苯甲酰環(huán)與蛋白中Gln53，IIe56，Arg57的相互作用在化合物14與蛋白的相互作用中沒(méi)看到，這又說(shuō)明了盡管二者作用位點(diǎn)相似，但連接子的引入確實(shí)影響了化學(xué)位移的變化。

圖6.相互作用示意圖，黃色部分為結(jié)合蛋白和配體NOE效應(yīng)的部分

從以上的實(shí)驗(yàn)可以看出化合物1的Kd=2uM，化合物3的Kd=0.1mM，當(dāng)利用連接子巧妙地連接兩個(gè)小分子配體后，得到的化合物活性都在nM級(jí)別。兩個(gè)配體可通過(guò)不同的連結(jié)子(linker)連接起來(lái)，這種連接可以從焓變和熵變對(duì)結(jié)合能的貢獻(xiàn)上得到理論支持[3]，這使得先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)效率實(shí)現(xiàn)了一個(gè)質(zhì)的飛越。

基質(zhì)溶解素（MMP-3）非肽類抑制劑先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)[4]

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是鋅依賴的家族內(nèi)切蛋白酶，包括膠原酶，明膠酶和基質(zhì)溶解素。該酶家族參與基質(zhì)降解和組織重塑，并且與表達(dá)或失調(diào)時(shí)與關(guān)節(jié)炎和腫瘤轉(zhuǎn)移等病癥相關(guān)。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了基于底物特異性設(shè)計(jì)的有效的基于肽的抑制劑，但是這類化合物大多表現(xiàn)出差的生物利用度。已發(fā)現(xiàn)幾種非肽天然產(chǎn)物可抑制這類酶，如聚天冬氨酸和四環(huán)素衍生物。然而，這些化合物僅表現(xiàn)出中等的抑制活性。利用核磁共振技術(shù)S. W. Fesik等人成功的找到了對(duì)基質(zhì)溶解素活性很高的先導(dǎo)化合物。

由于許多已知的MMP抑制劑含有異羥肟酸部分，用HSQC譜方法從化合物庫(kù)中篩選到乙酰羥胺(CH3CONHOH)對(duì)基質(zhì)溶酶的親和力很弱，Kd=17mM，由于它的分子較小以及在緩沖液中的溶解度較大(大于500mM)，未作任何優(yōu)化選作第一配體。

在飽和量的乙酰羥胺存在下，用HSQC譜方法發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯及其類似物可以結(jié)合基質(zhì)溶酶Kd在mM范圍，經(jīng)過(guò)近40余個(gè)聯(lián)苯化合物的結(jié)構(gòu)-活性研究比較(如下圖)，發(fā)現(xiàn)3'-氰甲基-4-羥基聯(lián)苯(26)與基質(zhì)溶酶的親合力Kd達(dá)0.02mM。 

圖7.基質(zhì)溶解素抑制劑第二配體結(jié)構(gòu)衍生物示意圖

通過(guò)對(duì)乙酰羥胺、3'-氰甲基-4-羥基聯(lián)苯類似物以及基質(zhì)溶酶的三元配合物的NMR研究，設(shè)計(jì)合成了11個(gè)化合物(45～55)，生物活性實(shí)驗(yàn)證明，與原有單體化合物相比，所有化合物的活性均有增強(qiáng)。對(duì)基質(zhì)溶酶最具抑制活性的化合物50和53其IC50分別為25和15nM，活性增強(qiáng)近千倍。 

圖8.基質(zhì)溶解素抑制劑藥物設(shè)計(jì)概括圖

“SAR by NMR”和組合化學(xué)的對(duì)比

“SAR by NMR”方法在概念上類似于組合化學(xué)，然而這兩種方法有本質(zhì)的區(qū)別，在組合化學(xué)中發(fā)現(xiàn)配體需要制備測(cè)試大量的化合物，不幸的是，合成方案的選擇和生物測(cè)定往往既困難又費(fèi)時(shí)，進(jìn)而相對(duì)統(tǒng)一的條件需要限制有用的分子構(gòu)建模塊及化合物的多樣性。在“SAR by NMR”方法中，配體已預(yù)選進(jìn)行了優(yōu)化，所以只需合成少數(shù)幾個(gè)化合物即可。另一方面“SAR by NMR”方法不同于組合化學(xué)，篩選小分子化合物的范圍僅僅受到水溶解度達(dá)mM濃度的限制，卻可以收集到多種多樣的化合物樣品[5]。

總結(jié)

以上介紹了核磁共振技術(shù)在新藥研發(fā)先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)中的運(yùn)用，需要注意的是這種核磁共振技術(shù)需要大量15N同位素標(biāo)記的結(jié)合蛋白，另外結(jié)合蛋白的分子量大都在40KD以下等一系列技術(shù)限制，不過(guò)目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了兩種不需要15N標(biāo)記蛋白的新方法-一維馳豫編輯和擴(kuò)散編輯NMR方法[6]，彌補(bǔ)了這種方法的不足。

SPA(閃爍分析法)存在著放射性污染的環(huán)保問(wèn)題，熒光分析法存在著底物濃度效應(yīng)，熒光猝滅效應(yīng)，化合物自身熒光干擾等問(wèn)題，高通量篩選過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性，自動(dòng)化程度高可是先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)效率低，而計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)則存在著力場(chǎng)選擇簡(jiǎn)單，計(jì)算過(guò)程繁瑣，與現(xiàn)實(shí)情況符合性存疑等問(wèn)題。新藥研發(fā)的技術(shù)變革從未止步，相信隨著核磁共振技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，將繼續(xù)提高先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)效率，使得整個(gè)新藥研發(fā)周期縮短。

參考文獻(xiàn)：

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[2] Discovering High-Affinity Ligands for Proteins:SAR by NMR[J]. Suzanne B. Shuker, Philip J.Hajduk, Robert P. Meadows,Stephen W. Fesik*. Science . 1996(274)

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[4] Hajduk PJ, Sheppard G, Nettesheim D G, et al. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119(25):5818.

[5] 核磁共振技術(shù)在構(gòu)效關(guān)系研究中的應(yīng)用[J].化學(xué)通報(bào)，2001(1)

[6] Hajduk PJ, Olejniczak E T, Fesik S W. J. Am. Chem. Soc., 1997, 119(50):12257.

(責(zé)任編輯：劉思慧)